Microarray immunologico in sospensione
Il microarray immunologico in sospensione è una tecnica che permette l'analisi simultanea di fino a 100 differenti biomolecole (proteine, peptidi o acidi nucleici) in un piccolo volume di campioni biologici.
Principio di funzionamento[modifica | modifica wikitesto]
La novità introdotta da questo saggio si basa sull'utilizzo di microsfere di polistirene (del diametro di 5,6 µm) a cui viene legato un anticorpo specifico per l'analita che si vuole quantificare. Queste microsfere sono coniugate a 2 fluorocromi in concentrazioni diverse, tali da determinare fino a 100 diverse regioni. Quindi ogni diversa microsfera, determinata da un'unica regione, sarà legata ad un anticorpo per un diverso analita e questo permette la rilevazione di più analiti, fino a 100 in uno stesso campione. L'esecuzione del saggio prevede:
- aggiunta di una combinazione delle diverse microsfere nei pozzetti di una apposita piastra per il saggio e lavaggi con una soluzione tampone; la piastra usata è costituita da pozzetti con fondo a filtro che consentono il lavaggio tramite aspirazione della soluzione tampone dal basso, in modo che le microsfere non vengano disperse;
- aggiunta dei campioni contenenti gli analiti incogniti e lavaggi con la soluzione tampone;
- aggiunta di un anticorpo secondario coniugato a biotina, questo anticorpo lega l'analita in un sito diverso rispetto all'anticorpo legato alla microsfera, e relativi lavaggi;
- aggiunta di streptavididina coniugata ad un terzo fluoroforo e relativi lavaggi
- risospensione delle microsfere in un tampone di lettura.
La camera di lettura[modifica | modifica wikitesto]
Lo strumento, basato sulla tecnologia Luminex xMAP, sfrutta lo stesso principio del citofluorimetro per rilevare reazioni che avvengono sulla superficie di microsfere fluorescenti. Le microsfere vengono aspirate da un ago e portate nella camere di lettura dove vengono fatte passare una ad una e colpite da 2 laser. Uno riconosce la regione della microsfera, e quindi il relativo analita riconosciuto dall'anticorpo a lei legato, andando ad eccitare i 2 fluorocromi che la determinano, mentre l'altro laser la quantifica perché eccita il fluoroforo legato sull'anticorpo secondario.
Applicazioni[modifica | modifica wikitesto]
Il saggio può essere eseguito su supernatanti (da 12 a 50 μl) di culture cellulari e tissutali, plasma, siero, fluido interstiziale adiposo, fluido di lavaggio bronco-alveolare, fluido cerebrospinale, fluido da lavaggio nasale, fluido peritoneale e fluido sinoviale, e inoltre in sistemi murini da tessuti di colon, rene, polmone, milza e sistema nervoso. Sono disponibili in commercio dei kit di applicazione di questa metodica per la quantificazione simultanea di citochine e fosfoproteine di uomo, topo e ratto. Inoltre le microsfere possono essere coniugate, grazie a semplici reazioni chimiche covalenti e stabili, a proteine, peptidi, anticorpi, DNA, aptameri o anche microrganismi interi, quali virus o batteri, in modo da essere usate come sistemi aperti.
Bibliografia[modifica | modifica wikitesto]
- Wright H et al., Multiplex cytokines profiling of initial therapeutic response in patients with chronic hepatitis C virus infection, Dig Dis Sci 50, 1793-1803 (2005)
- Powell C et al., Characterisation of the cytokine inflammatory response in LPS stimulated full-term cord blood, J Perinat Med 32, 440-445 (2004)
- Ishizu T et al., Intrathecal activation of the IL-17/IL-8 axis in opticospinal multiple sclerosis, Brain 128, 988-1002 (2005)
- Elkord E et al., Human monocyte isolation methods influence cytokines production from in vitro generated dendritic cells, Immunology 114, 204-212 (2005)