Gene reporter
Un gene reporter è un gene la cui attività è facilmente monitorabile mediante istochimica o metodi immunologici; esso codifica per un prodotto genico che può essere utilizzato per studiare l'attività di sequenze regolatrici di un altro gene di interesse.
L'espressione di questi geni è facilmente identificabile e quantificabile mediante semplici saggi, per questo motivo sono usati come marcatori selezionabili.
I geni reporter sono spesso usati come indicatori per valutare il successo della transfezione ovvero mettono in evidenza se un determinato gene è stato acquisito dalle cellule prese in considerazione e se il suddetto gene viene espresso correttamente. È importante quindi che il gene reporter usato non sia naturalmente espresso nelle cellule d'interesse.
Oltre che l'efficacia della transfezione i geni reporter possono essere usati anche per studiare:
- la forza di un promotore
- il destino intracellulare di un prodotto genico
- l'interazione tra due proteine
- l'interazione tra proteine e acidi nucleici
Tipi di geni reporter[modifica | modifica wikitesto]
I geni reporter più usati sono:
CAT (Cloramfenicolo O-acetiltransferasi)[modifica | modifica wikitesto]
È stato il primo reporter usato. In presenza di CAT (cloramfenicolo acetiltransferasi) e di un donatore di acetile (CoA marcato in C14), il cloramfenicolo viene acetilato dall'enzima producendo una miscela di molecole marcate che possono essere rivelate su TLC (cromatografia su strato sottile) o tramite autoradiografia. Successivamente per evitare l'uso di sostanze radioattive si è ricorsi all'uso del gene lacZ di E.coli che codifica per la β-galattosidasi e poi alla luciferasi.
Gene LacZ (β-galattosidasi)[modifica | modifica wikitesto]
Il gene LacZ codifica per la β-galattosidasi che è un enzima idrolitico che catalizza nei polisaccaridi noti come beta-galattosidi tramite la rottura dei legami beta-glicosidico. Questo enzima provoca la colorazione delle cellule che lo esprimono quando esse si trovano in un terreno contenente X-Gal (X-galattosio) che idrolizzato genera un prodotto di colore blu (tecnica detta di screening bianco-blu).
Dato che CAT e la β-galattosidasi sono enzimi stabili la cui attività permane a lungo nelle cellule che li esprimono, qualora si volessero osservare rapidi cambiamenti nell'espressione genica tali reporter non potrebbero essere utilizzati. Si è ricorsi, per ciò, all'uso della luciferasi.
Luciferasi[modifica | modifica wikitesto]
La luciferasi è un enzima che catalizza l'ossidazione della luciferina, una reazione che, in presenza di un eccesso di ATP, ossigeno e ioni magnesio, perde energia (elettroni) sotto forma di radiazione luminosa che può essere rivelata con un luminometro. Tale reazione ha un'altissima sensibilità e ha un rapido decadimento.
GFP (Green Fluorescent Protein)[modifica | modifica wikitesto]
La GFP (Green fluorescent protein) deriva dalla medusa Aequorea victoria. Data la sua capacità di emettere luce dopo esposizione UV, viene usata come marcatore per individuare la locazione di particolari proteine o per studiare l'espressione genica all'interno delle cellule. La sua struttura è organizzata in 11 foglietti β con disposizione a barile che circonda il fluoroforo.
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