Fago M13
| Fago M13 | |
|---|---|
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| Classificazione dei virus | |
| Dominio | Acytota |
| Gruppo | Gruppo II (Virus a ssDNA) |
| Famiglia | Inoviridae |
| Genere | Inovirus |
| Specie | Fago m13 |
Il Fago M13 è un fago filamentoso, è costituito da DNA a singolo filamento ed è maschio-specifico perché penetra nella cellula ospite attraverso il pilus.
Ciclo vitale[modifica | modifica wikitesto]
Il fago M13 assorbe sul pilus attraverso una proteina del capside Gp3. Il filamento di Dna che penetra nella cellula è a singolo filamento ed è chiamato "+ strand". Una volta entrato nella cellula il DNA viene convertito in una molecola circolare a doppio filamento chiamata "Replicative form" (RF). Il DNA ds viene più volte replicato e contemporaneamente vengono trascritti i geni che codificano per le proteine strutturali del fago. Quando sono state sintetizzate circa 100-200 copie del fago, il prodotto del gene 5 (Gp5) si lega ai filamenti + ss e impedisce che vengano replicati. I filamenti possono così interagire con la membrana della cellula attraverso Gp7 e Gp9 e una volta preso contatto Gp5 viene rimpiazzato da Gp8 e Gp3. Il fago così assemblato viene estruso dalla cellula senza lisarla.
Replicazione del genoma[modifica | modifica wikitesto]
Il Dna del fago che entra nella cellula è a singolo filamento e viene chiamato " + strand". Appena penetrato, l'RNA polimerasi della cellula ospite sintetizza un primer all'origine di replicazione. La DNA polimerasi III dell'ospite inizia a sintetizzare il filamento complementare che viene definito "- strand". Quando Pol III incontra il primer dissocia dal DNA. La DNA Pol I con attività 5' esonucleasica rimuove il primer e riempie il "gap". Infine la Ligasi salda i due tratti di DNA. La sintesi del filamento - dà origine ad un DNA a doppio filamento chiamato "Replicative form". I due filamenti - e + della RF sono poi replicati separatamente e con due meccanismi differenti. Il prodotto del gene 2 è una endonucleasi che produce un nick sul filamento + della RF e rimane attaccata al fosfato in 5' lasciando l'estremità 3' libera. La proteina Rep dell'ospite è una elicasi che aiuta a svolgere il DNA all'altezza del nick. La DNA Pol III dell'ospite utilizza l'estremità 3' libera come primer per la sintesi di un nuovo filamento + mentre il vecchio viene rimosso. Una volta completata la replicazione si ottengono due molecole di DNA: una circolare a doppio filamento e una a singolo filamento dove Gp2 salda le estremità 5' e 3' con una reazione di transesterificazione e ricrea un filamento circolare +. Tale processo continua fino a quando comincia ad accumularsi Gp5. Questa proteina si lega al DNA single-strand + e impedisce che venga ulteriormente replicato.
M13 come vettore di clonaggio[modifica | modifica wikitesto]
Poiché il DNA di M13 è a singolo filamento, questo batteriofago rappresenta un conveniente vettore per il clonaggio del DNA. La lunghezza del suo genoma non è fissa e per questo è in grado di accettare DNA estraneo senza compromettere la vitalità del fago. Un particolare vettore di clonaggio che sfrutta il ciclo vitale del fago M13 è chiamato "Phagemid".
Il Phagemid è una molecola circolare di DNA a doppio filamento che contiene un'origine di replicazione plasmidica (Ori V) e l'origine di replicazione di M13 ma non contiene i geni che codificano per le proteine strutturali del fago. Nel phagemid può essere clonata una sequenza di DNA di interesse e che si desidera venga espressa in una popolazione di cellule sfruttando l'infezione fagica. Poiché il phagemid contiene solo l'origine di replicazione fagica non è in grado di generare le proteine strutturali necessarie per l'assemblamento del fago e per il packaging del dna al suo interno. Per questo motivo viene utilizzato l'Helper Phage M13K07. Tale fago contiene una origine di replicazione e codifica per tutte le proteine strutturali del fago. Quando le cellule contenenti il Phagemid vengono superinfettate con M13K07, Gp2 riconosce come origine fagica quella presente sul Phagemid che di conseguenza viene replicato ed impaccato insieme alle proteine strutturali codificate dall'Helper Phage.
Voci correlate[modifica | modifica wikitesto]
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